date:2023-05-18 13:40:31
免疫熒光實(shí)驗(yàn)
ibidi提供了一種簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)高效的方案，使用ibidi3孔可移除腔室載玻片（80381）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、固定和染色。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞并用福爾馬林溶液固定。細(xì)胞核用DAPI染色，肌動(dòng)蛋白骨架用DYE-490鬼筆肽染色。可通過(guò)使用圓形的15mm蓋玻片來(lái)減少所需的染色溶液的量。利用一級(jí)和二級(jí)抗體染色，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)可以探測(cè)其他細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。
實(shí)驗(yàn)使用的材料：
所使用的材料和試劑如下所示。此外，還需要配備一臺(tái)有適當(dāng)濾光片組的倒置或正置熒光顯微鏡。
·3孔可移除腔室載玻片（ibidi，80381）
·3孔可移除培養(yǎng)專用圓形15mm蓋玻片及配套工具，（ibidi，10815）
·細(xì)胞：MCF-7（CLS，300273）
·細(xì)胞培養(yǎng)基
·細(xì)胞培養(yǎng)試劑
·PBS
·福爾馬林中性緩沖液，10％（Sigma，HT5011）
·染色試劑
o DAPI（Sigma，D954）
o DYE-490鬼筆環(huán)肽（Dynomics，490-33）
·封片劑：FluoroshieldTM（Sigma，F(xiàn)6182）
實(shí)驗(yàn)方案
細(xì)胞培養(yǎng)，固定，染色和成像觀察--都是在一個(gè)開(kāi)放型小室中搞定：）
第1步：
必須在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定細(xì)胞系的正確接種濃度。根據(jù)您的細(xì)胞類型，用2-6x104細(xì)胞/ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層。
1. 在無(wú)菌條件下，打開(kāi)3孔可移除腔室載玻片（ibidi，80381）包裝。
2. 像往常一樣對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶化和計(jì)數(shù)。MCF-7細(xì)胞濃度為3×104細(xì)胞/ml 。
3. 將1100μl細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個(gè)孔中。避免搖晃，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。為獲得更均勻的細(xì)胞分布，請(qǐng)使用3孔可移除培養(yǎng)專用圓形15mm蓋玻片。
4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5％CO2下培養(yǎng)。
5. 細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時(shí)，或直到建立融合的單層。
第2步：
固定是染色程序的第一步。目的是將細(xì)胞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織維持在當(dāng)前狀態(tài)，并通過(guò)化學(xué)試劑在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保存制劑。
1.小心地抽吸細(xì)胞培養(yǎng)基。
2.用PBS洗兩次。
3.加入1100μl福爾馬林溶液。
4.室溫下孵育30分鐘。
5.小心地抽吸福爾馬林溶液。
6.用PBS洗滌三次
第3步：
應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白骨架。
1.準(zhǔn)備你的染色溶液：
· PBS
· DYE-490鬼筆環(huán)肽（每單元/玻片，50 μl/單元）
· DAPI 1μg/ml
2.小心吸出PBS。
3.用蓋玻片拾取工具抓取15毫米的圓形蓋玻片，并將其放置在腔室孔內(nèi)的圓形邊緣上。
4.將移液管尖端插入其中一個(gè)角槽中，將150μl染色液移入孔中。
5.在室溫下避光孵育30分鐘
第4步：
染色后清洗樣本可最大限度地減少背景信號(hào)
1.通過(guò)在一個(gè)角槽中添加950μl緩沖液來(lái)移除蓋玻片。
2.用Coverslip Pick-Up Tool蓋玻片拾取工具或鑷子抓取漂浮的蓋玻片，將其從孔中取出。
3.如有必要，重復(fù)洗滌步驟，抽吸緩沖液并在每孔中移液1100μl緩沖液。圓形的15毫米蓋玻片無(wú)需額外的洗滌步驟。
第5步：
從一個(gè)邊緣開(kāi)始，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應(yīng)以緩慢，穩(wěn)定的進(jìn)行，以避免損壞細(xì)胞層。
第6步：
完成染色程序后，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還可防止樣品脫水。
1.將載玻片側(cè)面在干凈的實(shí)驗(yàn)室濕巾上輕敲，去除樣品中多余的介質(zhì)。
2.將封固劑涂在樣品上。用24 x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝好的樣品，小心地將蓋玻片放到封片劑上，以避免夾住任何氣泡。
Tip：建議使用硬化封片劑，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。
3.等封片劑固定好。
第7步：顯微觀察
使用可移除3孔腔室載玻片培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。用DAPI和染料490對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色。圓形15mm蓋玻片減少了所需的染色溶液的量。用硬化封片劑安裝載玻片，可使樣品長(zhǎng)期保存。
圖1 MCF-7細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白骨架用DYE 490鬼筆肽染色（左上），細(xì)胞核用DAPI染色（右上）。下圖顯示了合成圖像，細(xì)胞核為藍(lán)色，肌動(dòng)蛋白骨架為綠色。（比例尺：100μm）
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