date:2022-09-22 11:17:25
活細胞成像是現(xiàn)代細胞培養(yǎng)中最引人入勝的技術之一。它不僅使我們能夠像其他成像方法一樣看到我們細胞的實時快照，而且是我們看到我們的細胞活動的唯一方法。了解它們如何移動、遷移，如何交流，如何進行細胞分裂，以及它們如何排泄、分泌、吞噬和進食。活細胞成像幫助我們了解生物過程。但與所有方法一樣，在進行活細胞成像時需要注意一些事項，從細胞培養(yǎng)參數(shù)到技術方面，再到分析數(shù)據(jù)的最佳方法。
我們用活細胞成像來研究周圍神經(jīng)系統(tǒng)細胞（如神經(jīng)細胞、Schwann細胞、神經(jīng)元成纖維細胞）和用于組織重建的各種生物材料之間的相互作用。由于時間是神經(jīng)再生的關鍵因素，我們對增強Schwann細胞的遷移潛力尤為感興趣，Schwann細胞需要快速到達并橋接損傷部位以引導再生軸突。
強烈建議對細胞行為和過程感興趣的每個人都使用活細胞成像進行研究。以下是我們提供的一些提示，可幫助您從一個全新的境界來了解您的細胞。
1、確保您擁有合適的細胞培養(yǎng)小室
首先，您需要確定哪些因素具有視覺意義。您只是想可視化您的細胞遷移嗎？或者您是否想研究您的細胞是否將遷移方向改變?yōu)樘囟ǖ纳L因子？有多種細胞培養(yǎng)室可用于活細胞成像，特別是ibidi提供了各種完全適合您需求的選項。例如， µ-Slide Chemotaxis chambers 細胞趨化載玻片（圖1）通過提供允許添加各種因素的細胞室來實現(xiàn)實時趨化性測量。細胞被接種在兩室的中間，并且可以分析細胞優(yōu)先地遷移到哪一側。大多數(shù)情況下，我們使用µ-Slide 4 Well用于我們的活細胞成像實驗，因為它們較大的區(qū)域允許在一個孔中觀察多個位置。另一種選擇是µ-Slide 4 Well ph+，它有一個特殊的中間擋板，可實現(xiàn)相差和高端熒光顯微鏡的出色圖像。有許多不同的腔室可供選用，其中有一些我們還沒有嘗試過，但將來肯定會嘗試。如果您有使用任何其他腔室載玻片的經(jīng)驗以及如何使用它們的，請告知我們！
圖1) ibidi µ-Slide Chemotaxis
2、關于細胞：周密計劃您的樣品制備
接下來，重要的是要考慮如何準備細胞。根據(jù)細胞類型、移動速度和數(shù)量增長速度，需要確定各種參數(shù)。例如，Schwann細胞需要一些時間來沉淀，因此在接種后幾小時開始活細胞成像實驗是有意義的。此外，一些細胞往往會受到細胞間接觸的影響，因此重要的是要考慮正確的細胞播種數(shù)，不同的研究的對象存在差異。因此考慮不同的細胞接種數(shù)量是很重要的。最后，決定細胞是否需要額外的包被也很重要。
3、讓您的細胞在顯微鏡下保持活力和快樂
一旦細胞準備好，我們就可以去顯微成像。不幸的是，并非所有顯微鏡都可用于活細胞成像。重要的是，它們得配備一個內置的培養(yǎng)箱，可調節(jié)CO2的濃度和溫度，以保持細胞存活。我們將奧林巴斯 IX83 與ibidi Stage Top Incubation System加熱孵育系統(tǒng)結合使用（見圖 2）。它為我們提供了對溫度和CO2以及濕度的精確控制。我們通常在 37°C 和 5% CO2、 50%濕度的恒定溫溫下進行活細胞成像實驗。有兩種不同的加熱板可供選擇，一種用于單腔載玻片，另一種用于一次對四個腔載玻片進行成像，非常適合大量實驗。
圖2) ibidi Stage Incubation System加熱孵育系統(tǒng)
4、選擇合適的顯微鏡和錄制設置
把腔室載玻片固定在加熱蓋下的板上，就可以開始實驗了。需要考慮的重要事項是顯微鏡的放大倍率、系統(tǒng)應該多久拍照一次以及拍攝多長時間。例如，由于Schwann細胞是快速移動的細胞，因此使用比成纖維細胞更低的放大倍數(shù)是意義的，成纖維細胞的移動速度要慢得多，遷移距離更短。我們使用cellSens Olympus Corporation軟件每10分鐘拍攝一張照片，持續(xù)至少10小時，這個是為與細胞速度和覆蓋距離相關的遷移實驗的而做的良好設置。如果您對細胞如何移動或對截然不同的事物感興趣，例如細胞如何吸收粒子，則縮短拍攝照片之間的時間可能是有意義的。
5、通過分析數(shù)據(jù)量化實驗
實驗結束后，在我們的案例中，軟件呈現(xiàn)的.vsi 文件，我們通常會將這些文件轉換為.avi視頻和.tiff 圖像序列。然后，使用ImageJ，我們使用手動跟蹤插件通過跟蹤并單擊每一幀中的單個單元格來跟蹤選定的單元格。每個單元格都有單獨的遷移路徑。然后，使用 ibidi Chemotaxis and Migration Tool評估結果，該工具可以計算平均速度、平均總距離和有效距離，以及每個單元格的方向性指數(shù)（見圖3）。
圖3：ibidi Chemotaxis和遷移工具插件的界面
最后，您可以從中獲得令人驚嘆的數(shù)據(jù)：
參考：
F. Millesi, T. Weiss, A. Mann, M. Haertinger, L. Semmler, P. Supper, D. Pils, A. Naghilou, C. Radtke. Defining the regenerative effects of native spider silk fibers on primary Schwann cells, sensory neurons, and nerve-associated fibroblasts. FASEB Journal.2021,10.1096/fj.202001447R
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